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ELISA法檢測干擾素
更新時間:2011-12-03   點擊次數(shù):1495次

干擾素(IFN)是一類具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì),僅在同種細胞上發(fā)揮作用。根據(jù)其來源、理化及生物學性質(zhì)的不同,可分為IFN-α、IFN-β、IFN-γ3種干擾素。其中,IFN-α主要由白細胞產(chǎn)生,IFN-β由成纖維細胞產(chǎn)生,IFN-γ主要由T細胞在免疫應(yīng)答中受到抗原或絲裂原活化后分泌產(chǎn)生。3種干擾素中,IFN-α、IFN-β抗病毒作用較強,IFN-丁免疫調(diào)節(jié)作用較強。目前已可用基因重組技術(shù)制備干擾素投入臨床使用。干擾素不能直接滅活病毒,其抗病毒作用是由于它能激活細胞內(nèi)抗病毒蛋白基因,制造抗病毒蛋白,抑制病毒在體內(nèi)復制。干擾素不僅可抑制已感染細胞內(nèi)病毒的復制,而且還可使未感染細胞處于抗病毒狀態(tài),對中斷病毒的細胞間傳播有一定作用;但對病毒整合基因可能僅有暫時抑制其mRNA的轉(zhuǎn)錄作用,不能清除病毒基因。干擾素的免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)為它是重要的巨噬細胞活化因子(macro-phageactivating factor,MAF),活化的巨噬細胞能殺死病原微生物或殺傷腫瘤細胞。干擾素能增強各種細胞表達MAF分子從而有利于遞呈抗原或利于T細胞對靶細胞的識別和殺傷;還能促進T、B細胞的分化,活化NK細胞和中性粒細胞,從而有助于加強免疫應(yīng)答。由于干擾素不是一種淋巴細胞的生長因子,故常抑制淋巴細胞(特別是B細胞)的增殖。
IFN抗病毒活性的特點如下:①僅僅是抑制作用,IFN消失后病毒將重新復制,因此必須足量反復應(yīng)用;②有相對的種屬特異性,IFN-γ較IFN-α、IFN-β嚴格;③IFN不直接滅活病毒,而是通過細胞基因組產(chǎn)生另一些蛋白因子來發(fā)揮效能,因此不同細胞對IFN的敏感性不同;④不同感染狀態(tài)的病毒-細胞系統(tǒng)對IFN的敏感性不同,病毒大量復制、引起細胞炎癥應(yīng)答時,IFN易產(chǎn)生效應(yīng);對完整細胞中的整合型病毒無作用。
[檢測方法] ELISA法
[方法學原理] 抗人IFN抗體包被在微孔反應(yīng)板上,待測標本和標準品中的IFN會與抗人IFN抗體結(jié)合,游離的成分被洗去,同時加入生物素化的抗人IFN抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素。生物素與親和素特異結(jié)合,抗人IFN抗體與結(jié)合在單克隆抗體上的人IFN結(jié)合而形成免疫復合物,游離的成分被洗去。加入顯色劑,若反應(yīng)孔中有IFN,HRP會使五色的顯色劑呈現(xiàn)藍色,加終止液變。在波長450nm處測吸光度,IFN濃度與吸光度成正比,可通過繪制標準曲線求出標本中的IFN濃度。
[標本準備] 靜脈血2ml,不抗凝。
[試劑)
1.預包被微孔反應(yīng)板
2.濃縮酶結(jié)合物
3.酶結(jié)合物稀釋液
4.標準晶和標本稀釋液
5.濃縮生物素化抗體
6.TFN標準品
7.濃縮洗滌液
8.顯色劑A、B
9.終止液
[儀器] 酶標儀或全自動酶聯(lián)免疫檢測儀。
[檢測步驟]
1.在微孔反應(yīng)板相應(yīng)孔中分別加入待測樣本、不同濃度標準品100ul,再加生物素化抗體工作液50ul。
2.振蕩混勻,置20~25℃環(huán)境中溫育120min。
3.將孔內(nèi)液體吸干,用洗滌液充分洗滌5次,干燥。
4.除空白孔外,加入酶結(jié)合物工作液100u1。
5.振蕩混勻,置20~25℃環(huán)境中溫育30min。
6.將孔內(nèi)液體吸干,用洗滌液充分洗滌5次,干燥。
7.每孔加入顯色劑A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃環(huán)境中避光顯色10min。
8.加入終止液50gl后,輕輕振蕩混勻。用酶標儀(450nm波長)測定各孔吸光度,與標準曲線對照,求出IFN值。
[正常參考值] 各實驗室可根據(jù)檢測方法的不同確立正常參考值。
[注意事項]
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時應(yīng)在室溫環(huán)境中平衡30min后方可使用,來用完的微孔條用自封袋密封保存。
2.酶標板洗滌時各孔均需加滿洗滌液,防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。應(yīng)設(shè)定30-60s的洗滌浸泡時間。
3。滴加試劑前應(yīng)將滴瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次,使液體混勻。滴加時瓶身應(yīng)保持垂直,以使滴量準確。
4.所有樣品和廢棄物都應(yīng)按傳染源處理。終止液為2mol/L硫酸,使用時應(yīng)注意安全
5.每批樣本應(yīng)同時做標準曲線。
6.檢測劑工作液按說明書臨用前配置。
7.若標本OD值在標準曲線測定范圍以外,應(yīng)適當稀釋后重測。
[臨床意義] IFN水平的改變主要見于自身免疫性疾??;在感染性疾病中,升高見于急性病毒感染,降低見于乙型肝炎病毒攜帶者、其他慢性病毒性肝炎及AIDS患者。
 

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